生命科学研究

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田彧, 陈慧, 周旻昱, 李俊, 肖俊, 冯浩

生命科学研究. 2018, 22(4): 259-270.

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在脊椎动物中viperin已被证明是一种能抵御大多数DNA和RNA病毒的抗病毒蛋白质。本文克隆及鉴定了青鱼viperin。青鱼viperin (bcViperin)的cDNA由1 828个核苷酸组成, 编码360个氨基酸。预测的bcViperin蛋白包含N端低保守的两性α-螺旋结构域、中间自由基S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)结构域及高保守C端结构域。bcViperin mRNA在青鱼心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、肌肉、皮肤和鳃等组织中均有表达。在草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)和鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus, SVCV)感染后, bcViperin mRNA在上述组织中的表达水平提高。在青鱼尾鳍(Mylopharyngodon piceus fin, MPF)细胞中, bcViperin mRNA表达水平同样会在GCRV和SVCV感染后发生上升。蛋白质免疫印迹表明bcViperin蛋白的相对分子质量约为42 kD; HeLa和EPC细胞中的免疫荧光染色实验表明bcViperin是细胞质蛋白。编码bcViperin的质粒在EPC细胞中过表达后能够显著提高细胞抵御SVCV和GCRV的抗病毒能力。以上研究表明bcViperin是青鱼天然免疫过程中重要的抗病毒蛋白质。

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氧化应激时Peroxiredoxin Ⅱ膜质转移对红细胞渗透脆性的影响

于佳斌, 卢悦, 张津松, 韩英浩

生命科学研究. 2018, 22(4): 271-276.

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为了探讨氧化应激时peroxiredoxin Ⅱ (Prx Ⅱ)膜质转移对红细胞渗透脆性的影响, 检测了H2O2处理后红细胞渗透脆性的变化, 并利用蛋白质免疫印迹法(Western-blot)检测了红细胞内Prx Ⅱ膜质转移情况, 以及红细胞膜蛋白——带3蛋白(band 3)和血影蛋白(spectrin)的变化情况。研究结果显示, 氧化应激时红细胞渗透脆性增加, 红细胞内Prx Ⅱ从细胞膜转移至细胞质中, 同时维持红细胞膜稳定、细胞骨架结构功能完整的相关蛋白质——band 3和spectrin在红细胞膜上表达量减少。实验结果证明氧化应激时红细胞内Prx Ⅱ发生膜质转移, 引起维持红细胞膜稳定、细胞骨架结构功能完整的相关蛋白质band 3和spectrin表达量降低, 导致红细胞渗透脆性增加。

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基于CRISPR/Cas9系统的人成神经瘤SK-N-SH细胞CAPNS1基因的靶向敲除

朱家佳, 龙鼎新

生命科学研究. 2018, 22(4): 277-282.

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利用CRISPR/Cas9技术靶向构建CAPNS1基因敲除人成神经瘤细胞SK-N-SH细胞系。在NCBI数据库查找人CAPNS1基因, 获得该基因CDS区, 根据CRISPR/Cas9敲除靶位点设计原则即gRNA设计原则, 设计3条sgRNAs, 以pGK1.1为载体, 构建人CAPNS1基因敲除载体, 并运用共转染的方法转染到SK-N-SH细胞, 构建CAPNS1基因敲除SK-N-SH 细胞系。结果发现, 菌落PCR筛选均能扩增出100 bp大小的片段, 单克隆为阳性, DNA测序显示sgRNA序列正确插入质粒, 序列比对结果正确; 质粒转染SK-N-SH细胞后, 制备单克隆, CruiserTM Enzyme酶切后疑似为阳性克隆, 进一步的单克隆测序结果显示CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功; 此外, 在CAPNS1-/-组, CAPNS1蛋白及calpain1和calpain2蛋白水平明显降低。以上结果表明CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功。

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人KIAA0146基因及蛋白质的生物信息学分析

周飞, 刘雪梅, 彭仲特

生命科学研究. 2018, 22(4): 283-290.

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KIAA0146是同源重组修复蛋白质复合体BLM/RAD51的支架蛋白质。当前KIAA0146相关的实验研究非常少。本文采用生物信息学方法对KIAA0146基因及其蛋白质进行快速分析以期为其往后的实验研究提供线索。首先发现KIAA0146基因存在多个转录起始位点及启动子, 且启动子(2 127~2 177 bp)和(3 127~3 177 bp)的侧翼各有2个CpG岛。然后发现KIAA0146是亲水的不稳定蛋白质。由于未发现KIAA0146蛋白包含信号肽和跨膜区域, 所以它可能既不是分泌蛋白质也不是跨膜蛋白质。但是KIAA0146可能是细胞核蛋白质, 在其N端包含核定位信号“RARGSKRKR”, 而且构建的KIAA0146蛋白的三级结构提示它可能具有核酸结合结构域。最后发现RAD51、ATM、RAD51B、MRE11A、BLM、DNA2、RMI1、BRCA1、BRCA2和XRCC2可能与KIAA0146相互作用, 而且KIAA0146可能通过与这10个蛋白质相互作用参与DNA损伤应答及修复、发育和细胞代谢调节等生物过程。总之, 文中对KIAA0146基因结构及其蛋白质的亚细胞定位、三级结构和潜在的分子功能等进行了预测分析, 为往后实验研究KIAA0146提供了重要的理论依据和新线索。

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Pfu DNA聚合酶的制备过程及其条件优化

韦慧, 曹贤明, 李昱龙, 涂中华, 樊奔

生命科学研究. 2018, 22(4): 291-297.

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聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)可以方便、快捷、准确地大量复制目的基因片段, 是分子生物学研究中不可或缺的技术手段。在PCR反应中, DNA聚合酶起着关键作用。Pfu酶(Pfu DNA polymerase)是DNA聚合酶的一种, 具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切核酸酶活性, 可在聚合酶链式反应中纠正错误掺入的碱基, 可以快速、高保真地扩增DNA片段, 在分子克隆和DNA测序当中运用十分广泛。本研究建立了一套Pfu聚合酶表达与纯化的详尽方案, 该方案利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)作为诱导剂, 在大肠杆菌BL21 (DE3)中异源表达Pfu酶, 然后利用Ni-NTA柱层析纯化制备。研究中对IPTG诱导时间、细胞破碎条件、缓冲液类型及其pH、粗酶液热处理温度与时间、洗脱液中最佳咪唑浓度等重要条件和参数分别进行了优化确定。实验结果表明, 使用该方案可以成功制备高产量高纯度的Pfu聚合酶, 完全满足常规PCR反应的要求。本研究建立的实验方法和技术参数, 十分适用于研究者小规模自主制备Pfu酶, 对于有大量分子克隆要求的课题组, 利用该方案自主制备Pfu酶能够显著节省科研成本。

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不同添加物对小花棘豆内生真菌酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1合成苦马豆素的影响

萨如拉, 席领军, 卢萍, 高峰, 杜玲

生命科学研究. 2018, 22(4): 298-304.

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苦马豆素(swainsonine, SW)是由小花棘豆等疯草植物中内生真菌通过酵母氨酸还原酶催化产生的一种吲哚里西啶生物碱, 牲畜过量采食含SW的疯草植物会中毒, 但是SW具有抗肿瘤和免疫调节活性等医学作用。文中以小花棘豆内生真菌野生株OW7.8及其酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1为研究对象, 在固体培养基中添加酵母氨酸、α-氨基己二酸、赖氨酸和哌啶酸培养内生真菌野生株和突变株, 利用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术测定SW, 比较不同培养时间下内生真菌野生株和突变株中SW合成动态变化, 并对所得数据用统计学软件进行方差分析。研究结果显示: 对照组OW7.8中SW含量高于M1; 添加前体物可提高菌体内SW的含量; 不同前体对SW合成的影响不同, 其中添加哌啶酸对SW影响最大。统计学分析结果表明: 菌株(基因型)、添加前体化合物对真菌SW合成均有显著影响。

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屎肠球菌降胆固醇作用的初步研究

吴边, 柳陈坚, 李雅迪, 尚云, 李晓然

生命科学研究. 2018, 22(4): 305-310.

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血液中胆固醇含量增加会严重威胁人类健康。利用皂化－比色法检测了22株屎肠菌株体外降胆固醇的能力, 结果显示屎肠菌株的胆固醇去除率在85.93%~21.25%之间。选取3株胆盐耐受能力较好的菌进行后续研究, 其中, 屎肠球菌SP5-6L的耐酸能力较差; JS2和ML13-5菌株具有一定的耐酸和耐胆盐能力; 3株菌株的胆盐水解酶活性都很高。在0.3%胆盐培养基中, 屎肠球菌的胆固醇去除率不同, 其中ML13-5菌株的去除率由52.71%增加到68.01%。此外, 屎肠球菌无溶血性, 但其抗药性各有不同。本文对屎肠球菌降低胆固醇的机制进行了初步研究, 为进一步利用其开发相关功能性食品和药物提供了依据。

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两种试剂盒提取大鼠容受期少量宫腔液胞外囊泡的比较

黄曦, 李艳萍

生命科学研究. 2018, 22(4): 311-319.

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容受期宫腔液对于胚胎建立早期妊娠起着关键作用, 宫腔液内含的胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)可能是子宫内膜与胚胎之间交流的新模式。目前为止, 仍然没有一种提取方法能同时保证EVs的含量、纯度和生物活性。传统的超速梯度离心法对设备和样本量要求高, 耗时长, 因此寻求在少量样本中高效提取高纯度EVs的新方法十分重要。本研究对同一份大鼠容受期宫腔液样本分别采取PEG沉淀和亲和膜离心柱两款试剂盒进行EVs提取, 使用透射电镜、Western-blot和动态光散射进行形态、表面蛋白质和粒径分布的鉴定, 并对其内容物RNA进行了浓度和片段分布比较。结果显示, 两种试剂盒都可以成功从少量的宫腔液样本中分离得到EVs, 且效率较传统离心法大大提高, 但均无法完全区分其亚群; 亲和膜离心柱提取法得到的EVs浓度更高, RNA片段集中在20~40 nt, 对于开展后续miRNA建库测序分析具有更好效果。

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几种肿瘤生物标志物研究方法及结果的比较

王婷, 高友鹤

生命科学研究. 2018, 22(4): 320-325.

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在肿瘤的预防、诊断和治疗中, 生物标志物有着极其重要的作用。生物标志物的研究可以通过人或者动物模型的体液、组织或细胞等进行。体液包括血液与尿液等, 研究者们主要关注血液, 对于尿液不够重视, 但理论上尿液不受机体稳态机制的调控, 应该可以更早更敏感地反映机体因疾病所产生的变化, 是生物标志物更为理想的来源。研究者们也直接从细胞培养的条件培养基、组织或者器官灌流液等处寻找差异蛋白质作为候选标志物。本文试图通过对肿瘤细胞的条件培养基、大鼠模型肝脏灌流液、尿液筛选差异蛋白质作为生物标志物的结果和方法进行比较, 分析三者的优缺点, 为以后的标志物研究提供线索。

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外泌体在肿瘤侵袭转移中作用的研究进展

宋丽杰, 王丽, 王捷

生命科学研究. 2018, 22(4): 326-331.

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外泌体(exosome)是多种细胞分泌的一种40~100 nm的由磷脂双层膜包裹的微囊体, 其组成主要包括脂质体、蛋白质、DNA及miRNA等。研究表明外泌体通过携带生物活性物质参与了机体许多重要的生理及病理过程, 尤其是在肿瘤的侵袭及转移方面。外泌体主要通过诱导肿瘤转移的启动、促进肿瘤血管生成、参与肿瘤转移前微环境形成及肿瘤微环境的免疫调控等途径, 在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用。

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核酸适配体在胰腺癌中的应用研究进展

韩冬梅, 邓堂刚, 叶茂

生命科学研究. 2018, 22(4): 332-337.

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胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma, PAC)是死亡率最高的癌症之一, 实现PAC的早期诊断和早期治疗具有重大意义。核酸适配体(aptamer, Apt)是通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)筛选得到的具有高亲和性、高特异性识别靶标分子的单链DNA或RNA, 被称为化学抗体, 其不仅具有类似抗体的特点, 同时还有易修饰、生产成本低、无免疫源性、识别范围广等优点, 因此在肿瘤诊断和治疗中具有很好的应用前景。目前, 已筛选得到的多个识别PAC的核酸适配体被广泛应用在PAC的诊断和靶向治疗中。文中主要综述了与PAC相关的核酸适配体, 对这一领域最新的研究进展进行了总结, 并对目前存在的问题和挑战进行了深入的讨论。

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抗菌肽鲎素的研究进展

李寒梅, 唐勇军, 王顺启, 代建国

生命科学研究. 2018, 22(4): 338-344.

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已报道的抗菌肽鲎素(tachyplesins, TPs)共分5种, 均由鲎血细胞分离产生, 是鲎先天免疫系统的重要功能物质, 为鲎机体抵抗病原物入侵提供天然防御屏障。近30年的研究表明, TPs抗菌肽显示出广谱生物活性、较低正常细胞毒性、不易产生微生物抗性等特点, 作为一种全新型的肽类药物备受关注。文中主要从TPs的分子结构, 对微生物、藻类细胞、肿瘤细胞及一些病毒的抑杀活性, 作用机制, 以及工程表达情况等方面进行介绍, 综述TPs的应用前景, 并对当前研究瓶颈进行评述。

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2018年, 第22卷, 第4期　
刊出日期：2018-08-31

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